引言

拉曼光譜技術(shù)作為一種快速、非破壞性的分析方法，正在成為制藥領(lǐng)域中最&受歡迎的分析測量工具之一，在原料驗證、藥物生產(chǎn)過程監(jiān)控以及產(chǎn)品質(zhì)量控制中都發(fā)揮了重要作用。拉曼光譜技術(shù)基于拉曼散射原理，通過測量樣品與激光光束相互作用后發(fā)生的光子能量變化，獲取樣品的化學(xué)成分和結(jié)構(gòu)信息。在實際運(yùn)用中，激光首先聚焦到樣品表面，激發(fā)出的非彈性散射信號（即拉曼信號）被收集并導(dǎo)入到光譜儀中，光譜儀對該信號進(jìn)行波長分離，再由探測器將光子能量轉(zhuǎn)換為電信號以供分析。拉曼光譜技術(shù)的一個顯著優(yōu)點是無需提取或制備樣品，并且激光可以輕松地聚焦到樣品來進(jìn)行化學(xué)測量，這通常可以在一分鐘或更短的時間內(nèi)完成。其快速、高靈敏度和高分辨率的優(yōu)勢使其成為了藥物研發(fā)和生產(chǎn)中的一項重要工具。本文將深入探討拉曼光譜在制藥領(lǐng)域中的具體應(yīng)用，包括藥物結(jié)構(gòu)表征、藥物形態(tài)分析、藥物質(zhì)量控制以及藥物相互作用研究，并結(jié)合真實案例進(jìn)行詳細(xì)分析。

1. 藥物合成研究

一旦確定了潛在的新藥，就可以開發(fā)、優(yōu)化該分子的合成方法。拉曼光譜非常適合監(jiān)測反應(yīng)物、中間體和產(chǎn)物濃度，確定各種反應(yīng)類型（例如Diels-Alder反應(yīng)、Fischer酯化反應(yīng)、格氏反應(yīng)和酰基化反應(yīng)等）的路徑、動力學(xué)、機(jī)制、終點和產(chǎn)率。阿司匹林的合成是一個經(jīng)典的酰基化反應(yīng)，反應(yīng)的歷程一般認(rèn)為有四面體結(jié)構(gòu)的中間體出現(xiàn)，但由于其純凈物難以分離獲取，所以一直沒有直接的證據(jù)證明該中間體的存在。利用拉曼光譜技術(shù)在反應(yīng)過程中進(jìn)行實時跟蹤檢測，可以得到在反應(yīng)過程中不同時刻的拉曼光譜（圖1 A），發(fā)現(xiàn)了阿司匹林的合成反應(yīng)過程中有中間體出現(xiàn)，并直接觀測到此中間體在波數(shù)為1694cm^-1的位置有一明顯的拉曼特征峰。光譜經(jīng)數(shù)據(jù)處理后，還可以獲得到各組分含量的相對變化曲線（圖1 B）。

圖1 （A）實驗過程中的拉曼光譜隨時間的變化；（B）阿司匹林合成過程中各組分的回歸系數(shù)及1694cm^-1位置的相對峰高隨時間的變化。

通過在線拉曼光譜可以清楚、直接地看到反應(yīng)的進(jìn)程，輕松確定反應(yīng)速率、速率常數(shù)和產(chǎn)量；在優(yōu)化反應(yīng)器溫度、催化劑濃度和類型的影響的同時，還可用于確定活化能和反應(yīng)終點以及優(yōu)化產(chǎn)率。

2. 藥物晶型研究

大多數(shù)情況下，原研藥企業(yè)會使用API最&穩(wěn)定的晶型以避免在生產(chǎn)儲存過程中發(fā)生晶型轉(zhuǎn)變。為保險起見，仿制藥企業(yè)通常會選擇與參比制劑（RLD）或原研制劑相同的API晶型，以保證相似的穩(wěn)定性和溶出特性。因此，確定原研制劑中API晶型是仿制藥研發(fā)的關(guān)鍵步驟，這也是逆向工程中最重要的任務(wù)。晶型檢測有著一系列可選擇的分析方法，如X射線粉末衍射、差示掃描量熱、熱重分析、紅外光譜及拉曼光譜等。然而，對于制劑中無定形或低含量API的晶型檢測，可用的方法就相對較為局限。

2.1制劑中無定形API的檢測

X射線粉末衍射被認(rèn)為是多晶型化學(xué)物質(zhì)指紋性和專屬性的首&選表征手段。一般制劑中的API晶型檢測相對直接，但當(dāng)API為無定形時，X射線粉末衍射檢測失去作用，如下所述案例。已知某制劑中API有2種固態(tài)形式:無定形和半水合物。為確定2個不同廠家生產(chǎn)的片劑（藥片A、B）中API晶型是否一致，首先需要應(yīng)用X射線粉末衍射對藥片A、B中API晶型進(jìn)行鑒定。對比藥片A、B與API的X射線粉末衍射圖可見，藥片A的X射線粉末衍射圖譜與API半水合物特征峰在整個圖譜上都有很高的吻合度（見圖2a和2d）。因為該API只能以無定形和半水合物形式存在，因此可以基本肯定藥片A所含API為半水合物。當(dāng)比較藥片B的X射線粉末衍射圖譜（見圖2b）與API半水合物時，很難判斷藥片B中的API是否也為半水合物。由于藥片中同時含有晶體輔料（如乳糖）和其他無定形輔料，藥片B中API的晶型無法通過X射線粉末衍射來確定。

圖2 藥片A、藥片B、無定形API和API半水合物的X射線粉末衍射圖

應(yīng)用拉曼光譜技術(shù)，比對圖3中藥片A、B與API的拉曼光譜圖。藥片A的拉曼圖譜與API半水合物的圖譜基本一致（見圖3a和3d）。同時，藥片B的拉曼圖譜與無定形API的圖譜基本一致（見圖3b和3c）。因此，在這種情況下，拉曼光譜可以很好地解決無定形API在制劑中的鑒定問題。通常，不同固態(tài)形式API的拉曼光譜間有一定差異。與結(jié)晶形API相比，無定形API的拉曼光譜表現(xiàn)為更寬的峰形，且有波數(shù)偏移。通過將實測樣品的拉曼光譜與不同晶型API的參考拉曼光譜進(jìn)行比對，可鑒定制劑中API的晶型。

圖3 藥片A、藥片B、無定形API和API半水合物的拉曼光譜圖

值得一提的是，通常輔料拉曼信號很弱，低于API信號，故拉曼技術(shù)用于不同廠家不同輔料的相同制劑時，可以在某些情況下完&全排除輔料對API的干擾。該特性極利于制劑中低含量API的晶型檢測，即使API的含量較低，其在制劑中的信號仍然有可能被檢測到，這對于制劑中API的晶型鑒定尤為重要。

2.2制劑中低含量API的檢測

某原研片中API含量較低，僅為0.5%。文獻(xiàn)報道API有A、B、E這3種晶型，且晶型E很難制備。比較原研片與文獻(xiàn)中3種晶型的X射線粉末衍射圖，未找到與3種晶型相對應(yīng)的衍射峰，再將原研片與片劑中主要輔料一水乳糖的X射線粉末衍射圖比較，發(fā)現(xiàn)其X射線粉末衍射圖與一水乳糖幾乎一致（見圖4），表明輔料一水乳糖嚴(yán)重干擾了制劑中API的衍射信號。

圖4 原研片與一水乳糖以及文獻(xiàn)中API晶型A、B、E的X射線衍射圖

應(yīng)用拉曼技術(shù)采集原研制劑的單點拉曼光譜，因單次采集樣品信號面積小，可相對有效避開大量輔料的影響，采集到較強(qiáng)的API信號。將已采集到的原研制劑中的拉曼圖譜與不同晶型的拉曼圖譜相比較，即可鑒定制劑中的API晶型。如圖5所示，該原研片采集到的單點拉曼光譜為較純的API光譜，不受一水乳糖的干擾，且晶型A、B有不同的拉曼特征峰，比對原研片與晶型A、B的拉曼光譜（見圖6），可明顯看出，原研片中的API為晶型A。

圖5 原研片和一水乳糖的拉曼光譜

圖6 原研片與文獻(xiàn)中API晶型A和B的拉曼光譜

3. 藥物質(zhì)量研究

凍干制劑中藥物分布均勻性在一定程度上可反映制劑微觀結(jié)構(gòu)的一致性，與凍干工藝密切相關(guān)。預(yù)凍方式、預(yù)凍時間、凍干曲線都可能影響到藥物和輔料的析出速度與程度，從而影響凍干物結(jié)構(gòu)和藥物分布均勻性。良好的凍干結(jié)構(gòu)能夠保證凍干過程中溶劑順利逸出，反之會增加溶劑揮發(fā)阻力。結(jié)構(gòu)上的不均勻可能會導(dǎo)致局部溶劑殘留增加，甚至可能會使活性藥物成分局部降解，影響產(chǎn)品穩(wěn)定性和體內(nèi)藥效以及毒性。因此藥物分布均勻性是凍干制劑的一個重要質(zhì)量屬性，可在多方面影響產(chǎn)品質(zhì)量和體內(nèi)性質(zhì)，有必要對其進(jìn)行評價。

近年來，基于不同光譜的顯微成像技術(shù)在藥物質(zhì)量表征和研究中得到越來越多的應(yīng)用，通過化學(xué)顯微成像可以在保持樣品完整的前提下直觀獲得樣品內(nèi)部的結(jié)構(gòu)信息。其中，采用拉曼光譜成像法評價藥物活性成分在制劑中的分布均勻性受到了較多關(guān)注，主要因為其可以在一定程度上反映產(chǎn)品制劑工藝特征，有助于產(chǎn)品質(zhì)量評價、工藝分析優(yōu)化以及偽藥劣藥鑒別。該評價方法在片劑中的應(yīng)用已相對成熟，采用夾峰法進(jìn)行成像處理，便可得到各成分在制劑中的分布成像圖。在評價注射用凍干制劑中藥物分布均勻性時，夾峰法進(jìn)行成像處理，結(jié)果發(fā)現(xiàn)即使將圖譜采集精度減小到步長1μm，也無法將制劑中的藥物和輔料區(qū)分，這是因注射用凍干制劑生產(chǎn)工藝與片劑不同導(dǎo)致的。片劑生產(chǎn)工藝中藥物和輔料為物理混合，且粉末粒度通常在微米級別，將圖譜采集步長減小到藥物輔料粉末粒度以下，采集到的拉曼光譜為單一成分的光譜圖，因此采用夾峰法成像可將藥物和輔料輕易區(qū)分，觀察到制劑中藥物成分分布的圖像。而凍干制劑通常將藥物和輔料先全部溶解于同一介質(zhì)中，經(jīng)過冷凍干燥過程將液體介質(zhì)去除形成固體凍干物。此時藥物在輔料中呈高度分散的狀態(tài)，大部分掃描點下的光譜圖中都同時含有藥物和輔料的特征峰，采用夾峰法成像無法將二者區(qū)分。基于內(nèi)標(biāo)法拉曼光譜定量分析的原理，可采用藥物-輔料峰強(qiáng)度比值法以二者特征峰的相對強(qiáng)度值對凍干制劑拉曼圖譜進(jìn)行成像處理。方法學(xué)驗證結(jié)果表明，該方法可以準(zhǔn)確反映凍干制劑中藥物與輔料的相對含量，以此對凍干制劑中藥物分布均勻性進(jìn)行分析與評價。同時研究中也發(fā)現(xiàn)，由于凍干制劑為疏松多孔的塊狀物，進(jìn)行拉曼光譜采集時掃描平面不如片劑平整，導(dǎo)致不同掃描點下的拉曼光譜圖信號強(qiáng)弱不一，而采用峰強(qiáng)度比值法進(jìn)行成像，以藥物輔料相對含量進(jìn)行評價，也可以很好地解決這一缺陷給均勻性分析帶來的影響。因此峰強(qiáng)度比值法比經(jīng)典的夾峰法更適合用于對凍干制劑中藥物分布均勻性的評價。

圖7 五種產(chǎn)品中培美曲塞二鈉（峰值1625cm^-1）和甘露醇（峰值480 cm^-1）在5個不同區(qū)域的拉曼強(qiáng)度相對比值成像圖。標(biāo)尺100μm。

4. 藥物制劑的鑒定

拉曼光譜法是重要的分子光譜技術(shù)，同紅外光譜一樣，可用于化合物結(jié)構(gòu)分析，可以對原料藥、輔料、藥物晶型、藥物制劑實現(xiàn)鑒別，其準(zhǔn)確度較高。由于水的拉曼散射效應(yīng)很弱，用拉曼光譜對水溶性注射劑測定時，水不干擾光譜。因此，拉曼光譜在對注射液品種的鑒別上具有紅外光譜無法比及的無前處理、簡單、準(zhǔn)確等優(yōu)勢。

目前已建立了拉曼光譜無損檢測液體制劑的快速篩查方法，其原理是通過從注射液的拉曼光譜中將來源于水及其他輔料部分有效排除，對活性藥物成分的拉曼光譜與標(biāo)準(zhǔn)參考光譜進(jìn)行對比判斷藥物的真?zhèn)蝸韺崿F(xiàn)鑒別。

《中國藥典》2010年版附錄已經(jīng)收載拉曼光譜法指導(dǎo)原則，2015年版藥典通則收錄拉曼光譜法為藥典方法，但還沒有在品種項下得到體現(xiàn)。在對2010年版藥典收錄的注射液各論中〔鑒別〕項的調(diào)研中，發(fā)現(xiàn)有氨茶堿注射液、氨甲環(huán)酸注射液等8個品種采用了紅外光譜法鑒別。由此可見，采用紅外光譜鑒別注射液，主要通過提取、純化、干燥，在得到純的藥物固體晶體或粉末的基礎(chǔ)上實現(xiàn)的。前處理的主要目的是消除水及輔料對紅外光譜圖的影響。拉曼光譜不用提純干燥，可以直接測試進(jìn)行鑒別。因此可以針對上述8個液體品種，探討使用拉曼光譜替代現(xiàn)有的紅外光譜鑒別，或者作為紅外光譜鑒別備選項的科學(xué)性和有效性。

圖8 氨茶堿注射液與氨茶堿對照品溶液的拉曼光譜圖

圖9 氨甲環(huán)酸注射液與氨甲環(huán)酸對照品溶液的拉曼光譜圖

由圖8、圖9可知，采用拉曼光譜法進(jìn)行鑒別，具有前處理簡單，鑒別準(zhǔn)確度與紅外光譜法相當(dāng)?shù)葍?yōu)勢，因此具有使用拉曼光譜替代現(xiàn)有的紅外鑒別項，或者作為紅外鑒別項的備選項的可能性。通過對152個注射液品種質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的調(diào)研，發(fā)現(xiàn)有23個注射液品種〔鑒別〕項下只有一般化學(xué)反應(yīng)，沒有采用儀器的方法；有143個品種的〔鑒別〕項下不包含分子光譜的方法。對于這些品種，拉曼光譜可以作為一個候選的鑒別方法，作為這些注射液品種鑒別的補(bǔ)充，結(jié)果將是科學(xué)的和有效的。

結(jié)論

綜上所述，拉曼光譜技術(shù)作為一種先進(jìn)的光譜分析方法，在制藥工程中發(fā)揮著重要作用。隨著技術(shù)的不斷發(fā)展和完善，相信拉曼光譜技術(shù)將在制藥工程中發(fā)揮越來越重要的作用，為藥物研發(fā)和生產(chǎn)提供更加可靠、高效的分析手段，助力制藥行業(yè)不斷取得新的突破和進(jìn)步。

奧譜天成是國產(chǎn)拉曼光譜儀領(lǐng)&軍&品牌，具有手持式、便攜式、科研級、工業(yè)在線級全系列拉曼產(chǎn)品線，能夠為藥物研究單位及工業(yè)企業(yè)客戶提供全場景的應(yīng)用解決方案。

奧譜天成生產(chǎn)的拉曼光譜儀產(chǎn)品系列（截止2020年12月）

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